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【【摘要】】 目的：建立高效液相法测定健脾益肾颗粒中补骨脂素和异补骨脂素含量的方法。方法：采用Agilent C18色谱柱（250 mm×4. mm，5 μｍ），流动相为乙腈-水（53∶41），检测波长为24 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为25℃。结果：补骨脂素在0.040 10～0.204 80 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=80.05X+1.452（r=0.999 9）；平均回收率为99.8%，RSD=1.00%。异补骨脂素在0.034 22～0.212 00 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=18.2 X+2. 53（r=0.999 9）；平均回收率为100.1%，RSD=0.81%。结论：本法操作简便，准确，重现性好，可用于健脾益肾颗粒的质量控制。
[关键词] 健脾益肾颗粒；补骨脂素；异补骨脂素；高效液相色谱法
[中图分类号] R9 9.4 [文献标识码] A [文章编号] 1 13-1210（2011）12（a）-010-03
Determination of Psoralen and Isopsoralen in Jianpi Yishen Granula by HPLC
LIU Jun′e1, LIU Junhong2, ZHAO Tieyan3
1.Department of Nutrition, the Military General Hospital of Beijing, Beijing 100100, China; 2.Department of Blood Transfusion, 2 4th Hospital of Taiyuan, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China; 3.Department of General Surgery, 2 4th Hospital of Taiyuan, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective: To establish an HPLC method for determining the contents of Psoralen and Isopsoralen in Jianpi Yishen Granula. Methods: Agilent C18 column (250 mm×4. mm, 5 μｍ) was used with acetonitrile- water (53∶41) as the mobile phase, the detective wavelength was at 24 nm, column temperature was 25℃. Results: There was a good linear relationship for Psoralen and Isopsoralen with the range of 0.040 10-0.204 80 μg, Y=80.05X+1.452 (r=0.999 9), and 0.034 22-0.212 00 μg, Y=18.2 X+2. 53 (r=0.999 9). The average recovery was 99.8% (RSD=1.00%) and 100.1% (RSD=0.81%) respectively. Conclusion: The methods is simple, accurate and repeatable. It may be practical to control the uality of Jianpi Yishen Granula.
[Key words] Jianpi Yishen Granula; Psoralen; Isopsoralen; HPLC
健脾益肾颗粒为中药复方制剂，由补骨脂、党参、枸杞子、女贞子、菟丝子和白术等多味中药组成，具有健脾益肾的功效，能提高机体免疫力、抑制肿瘤的双向调节作用，减轻放化疗等副作用以及减轻脾肾虚弱所引起的疾病。补骨脂为处方中的君药，其有效成分为补骨脂素和异补骨脂素。文献中多采用高效液相色谱法[1-2]、气相色谱法[3]、薄层扫描法[4]和毛细管电泳法[5]等来测定其有效成分的含量。为了更有效地控制健脾益肾颗粒的质量，本文采用高效液相色谱法测定健脾益肾颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的含量，并进行学研究，简便可靠，重复性好，能有效控制产品的质量。
1 仪器与试药
Agilent 1200液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司，包括：四元泵、在线脱气器、Chem station色谱工作站）；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
补骨脂素和异补骨脂素对照品（中国药品生物制品检定所），健脾益肾颗粒（北京长城制药，批号：0 0233）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent C18色谱柱（250 mm×4. mm，5 μｍ）；流动相：乙腈-水（53∶41）；检测波长：24 nm；流速：1 ml/min。
2.2 对照品溶液的制备
精密称定补骨脂素和异补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每毫升含20.22 μg和20.50 μg的补骨脂素和异补骨脂素溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取健脾益肾颗粒5 g，研细，精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，加入适量甲醇，超声30 min，放冷，滤过，滤液置于25 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按处方组成，取不含补骨脂的诸药，按“2.3”项下的方法制成阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件测定补骨脂素和异补骨脂素对照品、阴性对照及供试品溶液色谱图。结果表明，其他成分对补骨脂素和异补骨脂素测定雅干扰。见图1。
A
B
C
A.补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.补骨脂素；2.异补骨脂素
图1 健脾益肾颗粒中补骨脂素和异补骨脂素含量测定的高效液相色谱
2.5 线性关系考察
精密吸取不同体积的上述补骨脂素和异补骨脂素的对照品混合溶液。按“2.1”色谱条件分别进样，测定其峰面积。以峰面积Y为纵坐标，补骨脂素和异补骨脂素的进样量X（μg）为横坐标，进行线性回归，得补骨脂素的回归方程为Y=80.05X+1.452，r=0.999 9；异补骨脂素的回归方程为Y=18.2 X+2. 53，r=0.999 9。表明，补骨脂素在0.040 10～0.204 80 μg范围内呈良好的线性关系，异补骨脂素在0.034 22～0.212 00 μg范围内呈良好的线性关系。
2. 稳定性试验
取供试品溶液分别在0、2、4、 、8 h测定补骨脂素和异补骨脂素的含量。补骨脂素、异补骨脂素含量的RSD值分别为0.52%、0. 1%。测定结果表明，供试品溶液在8 h内基本稳定，补骨脂素和异补骨脂素含量雅明显变化，被测组分化学性质稳定。
2.1 精密度试验
精密吸取补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液，分别连续进样5次，计算相对标准偏差。补骨脂素、异补骨脂素含量的RSD值分别为0.38%、0.25%。测定结果表明，方法精密度良好。
2.8 重现性试验
取同一批健脾益肾颗粒5份，制备方法同“2.3”项下方法，依次测定补骨脂素和异补骨脂素的含量。补骨脂素、异补骨脂素含量的RSD值分别为0.82%、0.95%。测定结果表明，该方法重现性良好。
2.9 加样回收试验
采用加样回收法，精密量取已知含量的补骨脂素和异补骨脂素供试品溶液，共5份，分别精密加入一定量的补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液，制备方法同“2.3” 项下方法，依次测定补骨脂素和异补骨脂素的含量，计算回收率。其中回收率=（检出补骨脂素或异补骨脂素量-样品中补骨脂素或异补骨脂素量）/加入补骨脂素或异补骨脂素量×100%。结果显示，补骨脂素和异补骨脂素的平均回收率分别99.8%、100.1%，RSD值分别1.00%、0.81%。测定结果见表1、2。
表1 补骨脂素加样回收率试验（μg）
表2 异补骨脂素加样回收率试验（μg）
2.10 样品含量测定
取三批样品，制备方法同“2.3”项下方法，连续进样5次，分别测定补骨脂素和异补骨脂素的含量。三批样品中补骨脂素和异补骨脂素含量见表3。
表3 样品中补骨脂素和异补骨脂素含量测定结果（n=5）
3 讨论
通过对索氏提取法和超声提取法的比较，结果表明，两种方法测得的补骨脂素和异补骨脂素含量雅明显差异，因超声提取法方便，可操作性强，所以本实验选用超声提取法。同时通过预试，发现提取溶剂选择甲醇比较合适。分别考察了甲醇-水、乙腈-水等不同比例的流动相，结果显示，乙腈-水（53∶41）为流动相分离度更好，峰形对称，保留时间适宜，所以确定乙腈-水（53∶41）为流动相。
本研究所用的测量健脾益肾颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的定量分析方法，结果准确，重现性好，可作为控制该制剂质量的手段之一。
[参考文献]
[1] 郝旭亮,刘霞,倪燕,等.HPLC测定益肾康胶囊中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].中国中药杂志,200 ,31(11):1412-1413.
[2] 李振国,李忠保,王海波.HPLC法测定仙灵骨葆颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].中医研究,2009,22(1):25-2 .
[3] 马虹英.GC法测定补骨脂酊中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].中国药房,2010,21(23):2110-2111.
[4] 芦喜珍,彭莹,高涛.薄层扫描法测定速效生发喷雾剂中补骨脂有效成分的含量[J].中国实验方剂学杂志,2005,11(1):14-15.
[5] 叶静,肖美添,黄雅燕,等.胶束毛细管电泳测定补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].药物分析学杂志,2008,28(9):1531-1534.
（收稿日期：2011-10-12）
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