血小板粘附受体GPIbα 酶切机制的研究

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雅宝题库解析：
糖蛋白(GP)Ibα是血小板表面粘附受体GPIb-IX-V复合物中的一个亚基，其胞外部分含有VWF、凝血酶等多个蛋白的结合位点。GPIbα胞外部分被酶切，不仅使得血小板失去与VWF的结合功能，而且干扰凝血酶等参与凝血过程，因而，GPIbα酶切是血小板血栓形成和凝血的重要负反馈途径。但是，长期以来，GPIbα酶切机制尚不明确。自1986年以来，许多研究证明了钙依赖蛋白酶(calpain)在GPIb酶切中的作用，但calpain是细胞内蛋白酶，而GPIb酶切发生在细胞膜外，这一题目一直悬而未决。直到2004年，Bergmeier W 等用基因剔除的小鼠证明，解离素-金属蛋白酶17(ADAM17)才是直接酶切GPIb的蛋白酶。然而，ADAM17导致的GPIbα酶切的调控机制，以及calpain和ADAM17之间是否存在关联目前还不清楚。我们的研究发现，calpain抑制剂可部分抑制A23187、钙调蛋白(CaM)抑制剂和凝血酶诱导的GPIbα酶切，而ADAM17抑制剂则完全抑制GPIbα酶切；calpain和ADAM17抑制剂能完全抑制calpain激活剂dibucaine诱导的GPIbα酶切；calpain抑制剂不能抑制PMA、H2O2和NEM等ADAM17激活剂诱导的GPIbα酶切，而ADAM17抑制剂则能够完全抑制；活性氧(ROS)拮抗剂完全抑制PMA和H2O2诱导的GPIbα酶切，而对dibucaine和NEM诱导的GPIbα酶切没有抑制作用。同时，我们也检测了calpain底物talin和filamin A被酶切的情况，结果显示，calpain抑制剂完全抑制A23187、dibucaine、CaM抑制剂和凝血酶诱导的talin和filamin A酶切，而ADAM17抑制剂没有抑制作用。另外，为了验证calpain调控ADAM17活性的情况是否也存在于有核细胞，以及calpain调控GPIbα酶切是否通过酶切filamin A所介导，我们采用1b9和Δ551细胞株，对calpain调控ADAM17介导的GPIbα酶切进行了研究。结果显示，calpain抑制剂部分抑制A23187诱导的1b9和Δ551细胞GPIbα酶切，而ADAM17抑制剂则完全抑制。这些结果表明：(1) calpain不是直接酶切GPIbα的酶，ADAM17直接酶切GPIbα；(2) calpain位于ADAM17活化信号通路上游，通过调控ADAM17活性间接调节GPIbα酶切；(3) calpain调控ADAM17活性的机制也存在于有核细胞；(4) calpain调节GPIbα酶切不是通过对filamin A酶切所介导；(5) 调控ADAM17活性，存在calpain依赖和非依赖(可能通过产生ROS)两种方式。凋亡，又称程序性细胞死亡，自1997年首次报道无核血小板也能像有核细胞一样经历凋亡之后，近年来血小板凋亡已成为血小板研究领域的热点之一。研究发现，导致血小板凋亡的刺激因素，大多都能诱导血小板GPIbα酶切，然而，血小板凋亡与GPIbα酶切之间是否存在关联目前还不清楚。钙调蛋白(CaM)是由148个氨基酸残基组成，分子量为17 kDa的钙离子敏感蛋白，是细胞内钙离子信号的主要受体，参与调节细胞增殖、分化、迁移和凋亡等生理、病理过程。在血小板，CaM直接与几个膜受体的胞质域结合，其抑制剂与血小板孵育能诱导GPIbα、GPV和GPVI等胞外部分酶切，损伤受体介导的血小板功能。在有核细胞，特别是肿瘤细胞模型，抑制CaM能诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，然而，抑制CaM是否能够诱导无核的血小板凋亡目前还不清楚。我们通过检测线粒体跨膜电位 (ΔΨm) 去极化、caspase-3活化和磷脂酰丝氨酸(PS)暴露等凋亡指标证实，CaM抑制剂能够诱导血小板凋亡；同时，通过检测P-选择素表达和PAC-1结合证实，CaM抑制剂并不引起血小板活化，表明血小板凋亡和活化是由不同的信号通路所介导。另外，为了探讨血小板凋亡与GPIbα酶切之间是否存在关联，我们使用ADAM17抑制剂和caspase-3抑制剂进行研究，结果证实ADAM17抑制剂不抑制CaM抑制剂诱导的血小板ΔΨm去极化、caspase-3活化和PS暴露；而caspase-3抑制剂也不抑制CaM抑制剂诱导的血小板GPIbα酶切。上述结果表明，CaM抑制剂能够诱导血小板凋亡，同时，caspase-3介导的凋亡和ADAM17介导的GPIbα酶切可能是通过不同的信号通路所调控。这一系列研究的意义在于，当血小板受到多种生理、病理刺激，发挥了粘附、聚集等生理功能，起到止血作用和形成血栓的同时，又通过一系列信号转导机制启动了自身功能的负调控机制，使得GPIb膜外功能区被酶切，阻止了血小板的进一步粘附、聚集，从而阻止了血栓的无限制增大。利用该机制可以主动调控GPIb酶切，还为设计新型抗血栓药物提供了一条全新思路。另外，我们对血小板凋亡机制以及与GPIbα酶切之间关系进行了初步探讨，这些研究为认识血小板凋亡在调控血小板生理功能，尤其在相关疾病的发病机制和防治措施方面，做了一些奠基性工作。表明在病理、生理条件下，当血小板受到某些刺激，可导致血小板凋亡和GPIbα酶切的发生，从而使得血小板失去功能或从循环血液中被清除。血小板凋亡和GPIbα酶切可能是某些血小板减少或功能异常性疾病发生的致病机理之一。抑制或促进血小板凋亡的制剂，在血小板的保存以及相关疾病的治疗方面具有应用前景。

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