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摘要：采用形态学及分子生物学的方法对采集自武汉的豇豆根腐病分离物进行形态学和分子生物学鉴定。结果表明，菌株ＪＧＦ形态学上为茄腐皮镰孢菌；对ＪＧＦ菌株的核糖体ＲＮＡ基因内转录间隔区（ｒＤＮＡ－ＩＴＳ）进行了ＰＣＲ扩增和序列测定，并在ＧｅｎＢａｎｋ中进行了Ｂｌａｓｔ搜索和比对分析，根据ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析结果结合豇豆病株症状和病菌的形态学特征，认为武汉地区豇豆根腐病的病原菌为茄腐皮镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．）
【关键词】：豇豆根腐病；形态学；分子鉴定；ｒＤＮＡ－ＩＴＳ分析；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．
中图分类号：Ｓ４３６．４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）24－5107-03
Pathogeny Isolation and Identification of Cowpea Root Rot Disease and Sequencing
of Ribosomal rDNA-ITS
ＷＵ Ｒｅｎ－ｆｅｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｌｉ１，ＷＡＮ Ｐｅｎｇ２，ＨＵＡＮＧ Ｗｅｉ２
（１． Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Vｅｇｅｔａｂｌｅ Sｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６５， Ｃｈｉｎａ
２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｓｏｌａｔｅ ＪＧＦ ｆｒｏｍ ｃｏｗｐｅａ ｒｏｏｔ rot disease， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｗｕｈａｎ， ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ＪＧＦ ｗｅｒｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ． Ｔｈｅ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅ ＪＧＦ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｃｏｗｐｅａ ｒｏｏｔ rot disease ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｗｐｅａ ｒｏｏｔ rot disease； ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｒＤＮＡ－ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ
豇豆是我国主要蔬菜作物之一，其多季节、多模式、多花色和短周期栽培成为农民增收的主导性蔬菜。湖北常年种植面积４万ｈｍ２，武汉市豇豆种植面积约０．６７万ｈｍ２，作为“豇豆之乡”的武汉市新洲区双柳街，年种植约０．４万ｈｍ２次。但是生产中，常因栽培管理不当或环境条件的影响，造成病害的流行，特别是土传病害。豇豆根腐病（Ｃｏｗｐｅａ ｒｏｏｔ）［１］是豇豆的一种典型的土传病害，随豇豆种植年数的增加、面积的扩大、品种的变化等，已成为豇豆上发病最重、危害最大、防治最困难的病害。本研究从武汉地区豇豆种植区采集并分离发病豇豆根腐病病菌，并进行鉴定，为后续的研究提供基础材料和条件。
１ 材料与方法
１．１ 标本来源与病原菌的分离纯化
标样于２００９年采自武汉市蔬菜科学研究所试验基地。病原真菌的分离方法参照方中达［２］的植病研究方法有关介绍，选取新发病豇豆植株茎基部的根颈作为分离材料，进行常规组织分离，经单孢纯化、培养获得单孢菌株。
１．２ 致病性测定
采用Ｋｏｃｈｐｓ法将发病组织上分离到的病原菌纯培养物（孢子）制成悬浮液（１０５～１０６个孢子／ｍＬ）。采用自然伤根浸孢子液接种植株。取生长良好的无病豇豆苗，用无菌水将根颈部表面冲洗干净，然后使根完全浸在孢子悬浮液中３０ ｍｉｎ，接种后植株定植于装有灭菌沙土的花盆中。每个菌株接种 ８株苗，３次重复，以无菌水为对照。植株置于２５ ℃下光照培养箱中，接种后每隔１～２ ｄ观察１次。发病后，从病斑处再次分离病原菌，确认致病菌。
１．３ 病原菌形态学鉴定
１．３．１ ＰＤＡ上的病菌形态特征观察 将供试菌株接种到ＰＤＡ培养基上，２５ ℃恒温培养。７ ｄ后观察培养基上的菌落形态，制作玻片，光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征，并测量分生孢子的大小。
１．３．２ 产孢表型观察 产孢表型的观察采用滤纸片法。参照张天宇［３］的方法，取滤纸剪成比载玻片稍小的长方形，将中心挖一边长约１０ ｍｍ的方孔，灭菌后用无菌水润湿放于无菌载玻片上。挑取少量活化的菌丝块均匀涂于滤纸中央方孔的边缘，然后将载玻片置于铺有湿润滤纸的灭菌培养皿中，２５ ℃恒温培养。４８ ｈ后显微镜下观察产孢表型。
１．３．３ 形态学鉴定依据 根据菌落形态、生长速度和色素颜色，大型分生孢子的形状、顶细胞和基细胞的特征，小型分生孢子的有无、形状和着生方式，分生孢子梗的特征和瓶梗类型，厚垣孢子有无和着生位置等特征，参照Ｂｏｏｔｈ［４］的分类系统进行病原菌种的鉴定。
１．４ 病菌核糖体ＲＮＡ基因内转录间隔区（ｒＤＮＡ－ＩＴＳ）序列比较
１．４．１ 菌丝体的培养与收集 将斜面保存的菌株接种在ＰＤＡ培养基上进行活化。将活化后的菌株移接在铺有灭菌玻璃纸的ＰＤＡ平板上（每皿约３０ ｍＬ培养基），每皿均匀接种２个菌丝块，每菌株接２～３个平板。于２５ ℃暗培养４～６ ｄ后，用灭菌解剖刀刮取菌丝，置于４ ℃保存备用。
１．４．２ 基因组ＤＮＡ的提取 基因组ＤＮＡ采用十六烷基三甲基溴化铵（Cetrimoｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法提取和纯化［５］。将３００ ｍｇ菌丝体放入已灭菌的研钵中，倒入适量液氮充分研磨，将菌丝粉末装入灭菌的１．５ ｍＬ离心管中。每一离心管中加入６００ μＬ ２×ＣＴＡＢ提取缓冲液（０．７ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ， １０ ｇ／Ｌ ＰＶＰ－３６０， ２０ ｇ／Ｌ ＣＴＡＢ， ０．１％β－巯基乙醇），涡旋混匀，６５ ℃水浴锅中水浴３０ ｍｉｎ，期间颠倒混匀３次。每管加入６００ μｌ氯仿／异戊醇（体积比２４∶１）抽提液，充分混匀后于１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ。吸取上清液至干净离心管中，加等体积氯仿／异戊醇再抽提１次。将上清液转入干净的离心管中，加２倍体积的无水乙醇沉淀２０ ｍｉｎ，１６ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，去上清液，沉淀用７０％乙酸冲洗２次。将离心管置于３７ ℃温箱中干燥后用ＴＥ溶解沉淀，经１％琼脂糖凝胶电泳检测后－２０ ℃冰箱保存备用。
１．４．３ ＩＴＳ扩增 用真核生物核糖体ＤＮＡ通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４进行ＰＣＲ扩增［６］。其序列为，ＩＴＳ１：５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′，ＩＴＳ４：５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′。
１．４．４ ＰＣＲ反应条件 ＰＣＲ反应体系总体积为５０ μＬ，反应液组分为：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ４ μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２ μＬ，５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶０．３ μＬ，模板ＤＮＡ １０ ｎｇ，引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４（２５ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ，用ｄｄＨ２Ｏ使总体积达到５０ μＬ，在ＰＴＣ－１００ ＰＣＲ扩增仪上扩增。扩增条件：９５ ℃预变性４ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ；５４ ℃退火１ ｍｉｎ；７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，共３５个循环； ７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物委托南京金斯瑞生物公司进行纯化和测序。
１．４．５ ＩＴＳ序列分析 将测序所得的菌株的ＤＮＡ－ＩＴＳ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中核酸数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）中的ＩＴＳ区相关序列进行同源性比较。
２ 结果与分析
２．１ 病原菌的分离与培养
从田间采集的发病植株，切取病株茎基部的维管束组织，按常规的组织分离法进行分离。经组织分离，获得１个根腐病菌菌株ＪＧＦ。进行单孢纯化后，用于致病性测定。
２．２ 致病性测定
接种初期植株不显症状，接种１５ ｄ左右见部分植株萎蔫，拔出植株，发现其根部自根尖开始发生褐色病变，由侧根延及主根，致整个根系坏死腐烂，剖检病根，维管束呈红褐色，并可延及根颈部，对照植株不发病（图１）。
２．３ 病原菌形态学鉴定
２．３．１ ＰＤＡ上的病菌形态特征观察 菌株ＪＧＦ在ＰＤＡ平板上培养，其菌落边缘白色絮状，生长快，底奶油黄色。菌丝浓密，质地松软，隆起。大型分生孢子较易产生，弯或直筒形，两端钝圆，较肿，多数为３隔，大小为２０．６～４８．８ μｍ×２．５～４．０ μｍ；小型分生孢子微弯，为卵形或椭圆形，０～１个分隔，大小为６．４～１０．３ μｍ×２．５～３．６ μｍ；厚垣孢子较易产生，顶生或间生，单个球形或成对顶生，细胞壁粗糙（图２）。
２．３．２ 产孢表型观察 保湿培养２４ ｈ后在滤纸上可以观察到滤纸孔边缘的薄层菌丝向中央生长。培养４８ ｈ后在显微镜下观察菌丝直径、产孢表型。气生菌丝有隔、无色、细长多分枝，产生２种孢子，即大型分生孢子和小型分生孢子。大型分生孢子纺锤形至镰刀形，多数为３隔，大小为２０．６～４８．８ μｍ×２．５～４．０ μｍ；小型分生孢子梗发达而细长，分生孢子 ０～１个分隔，卵形至肾形，假头状着生，大小为６．４～１０．３ μｍ×２．５～３．６ μｍ（图３ａ，ｂ，ｃ）。菌落生长１０ ｄ左右大量产生厚垣孢子，厚垣孢子顶生或间生，多数单个，球形，直径７～１０ μｍ（图３）。
２．３．３ 病原形态学鉴定 通过对ＪＧＦ菌株菌落形态、色素颜色、分生孢子梗、大小分生孢子形态，厚垣孢子形态等特征描述，参照Ｂｏｏｔｈ检索方法确定，该豇豆根腐病病原为半知菌亚门茄腐皮镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．）。
２．４ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析
豇豆根腐病菌ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳，获得一个约为５６０ ｂｐ的扩增条带，与期望值相符。ＰＣＲ产物送南京金斯瑞生物公司进行序列测序结果表明，目的片段由５６６个核苷酸组成，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的序列用ＢＬＡＳＴ软件进行同源性分析。ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析表明，所分离的病原菌与ＧｅｎＢａｎｋ中已公布的Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＧＱ３６５１５４、ＡＢ４７０９０３、ＥＦ１５２４２６、ＡＢ３６９４８８、
ＡＪ６０８９８９）相应片段完全一致，同源性为１００％，能够比对上的碱基数目最多，Ｅ－ｖａｌｕｅ值为最小值０。根据生物信息学同源性比对的结果，将该菌鉴定为茄腐皮镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．）。此结果与形态学鉴定结果一致。
３ 小结与讨论
本研究在真菌鉴定上以形态学鉴定为基础，分子鉴定为补充，ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析结果作为形态学鉴定的辅助验证［７］。在病原菌鉴定中，主要根据病菌在ＰＤＡ和其他培养基上的菌落形态、色素、大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子的形态特征以及产孢表型参照Ｂｏｏｔｈ分类系统进行种级鉴定。根据孢子的形态和产孢表型将根腐病菌的菌株鉴定为Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．。在形态学鉴定的基础上，通过对病原菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区扩增所得序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ中的序列进行同源性比较。结果表明，根腐病菌株与Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｓｃｈｌ．的同源性最高为１００％，进一步验证了形态学鉴定结果。
参考文献：
［１］ 吕佩珂，李明远，吴钜文． 中国蔬菜病虫原色图谱［Ｍ］． 北京：中国农业出版社，１９９２．
［２］ 方中达． 植病研究法［Ｍ］．第三版．北京：中国农业出版社，１９９８．
［３］ 张天宇．中国真菌志（第十六卷）链格孢属［Ｍ］．北京：科学出版社，２００３．
［４］ ＢＯＯＴＨ Ｃ． Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ［Ｍ］． Ｌｏｎｄｏｎ： Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｄｉｎｇ，１９７１．
［５］ ＧＲＡＨＡＭ Ｇ Ｃ， ＭＡＹＳＥＲ Ｓ Ｐ， ＨＥＮＲＹ Ｒ Ｊ． Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，１６：４８－５１．
［６］ 刘春来，文景芝，杨明秀，等．ｒＤＮＡ－ＩＴＳ在植物病原真菌分子检测中的应用［Ｊ］．东北农业大学学报，２００７，３８（１）：１０１－１０６．
［７］ 孙广宇，彭友良，李振岐，等． 核苷酸序列分析在真菌系统学研究中的应用［Ｊ］．西北农林科技大学学报（自然科学版），２００３，３１（６）：１８７－１９１．
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